Форум РМС

Лечение в Москве - 8 (495) 506 61 01

Лечение за рубежом - 8 (925) 50 254 50

Преимплантационная генетическая диагностика: современное состояние и последние научные открытия

Идея применения методов преимплантационной генетики в клинической практике возникла давно. Еще в 1967 г. R.Edwards и R.Gardner успешно определяли пол у эмбрионов кролика, находящихся на стадии бластоцисты, и затем переносили их в полость матки [1]. Уже тогда эти ученые предсказывали применение аналогичных технологий у человека во избежание передачи наследственных заболеваний от родителей детям. Однако это стало возможным лишь в начале 90-х годов, когда была разработана техника полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая позволяла определять мутации в единичных клетках [2]. Первыми ПЦР для преимплантационной генетической диагностики (ПГД) в клинической практике применили А.Handyside и соавт. в 1990 г. С помощью ПЦР они детектировали специфические последовательности для хромосомы Y при определении пола эмбрионов у супружеских пар с X-сцепленными заболеваниями [3]. Однако из-за риска постановки неправильного диагноза при определении пола эмбрионов от ПЦР постепенно стали отказываться в пользу другого метода – флюоресцентной (нерадиоактивной) гибридизации in situ (FISH). Его преимущество заключалось в том, что можно было одновременно детектировать как X-, так и Y-хромосомы, и, как следствие, появилась возможность определять не только пол эмбрионов, но и анеуплоидии половых хромосом [4]. С тех пор за достаточно короткое время разработано много модификаций ПЦР и FISH, расширяется область применения этих методов в ПГД. В сентябре 1997 г. в Чикаго проходил симпозиум по преимплантационной диагностике, где были представлены новейшие разработки в области ПГД и результаты применения их в клинической практике.

ПГД с применением FISH

В настоящее время FISH применяется в большинстве ПГД центрах мира как предпочтительный метод при определении пола в случаях предупреждения передачи X-сцепленных рецессивных заболеваний. Однако, как считают ученые, FISH следует применять в программах ЭКО для всех женщин старшей возрастной группы. Установлено, что морфологически нормальные эмбрионы, полученные после проведения ЭКО у таких женщин, имеют значительное повышение анеуплоидий, которые могут приводить к спонтанным абортам или к отсутствию имплантации [5]. Кроме того, при использовании FISH в ПГД установлено, что хромосомный мозаицизм является общим явлением у эмбрионов на стадии дробления [6]. Было показано, что у фертильных супружеских пар анеуплоидии и/или мозаицизм эмбрионов встречаются с частотой 40–80% [7]. Это открытие имело важное значение для диагностики заболеваний, связанных с доминантными мутациями в единичных генах, моносомиями, трисомиями, а также для понимания развития человека на ранних эмбриональных стадиях.

Так как большинство анеуплоидий материнского происхождения и возникают они в результате нерасхождения хромосом во время мейоза I, в дальнейшем было предложено для их детекции использовать хромосомы первого полярного тельца (1ПТ). Анализ ПТ в сочетании с биопсией бластомеров позволил бы в дальнейшем выявлять анеуплоидии, унаследованные от отца.

Y.Verlinsky и соавт. [8] провели генетическое тестирование ооцитов с анеуплоидиями у включенных в программу ЭКО пациенток старше 34 лет, анализируя с помощью FISH 1ПТ и 2ПТ. При детектировании общих анеуплоидий применяли микроманипуляционные методы, удаляли ПТ у 363 женщин и исследовали их с помощью FISH, используя специфические зонды для хромосом 13, 18 и 21. В 538 ЭКО циклах было извлечено 3250 ооцитов; результаты по FISH были получены для 2742 (84,3%) ооцитов. У 1102 (40%) ооцитов детектировали анеуплоидии (при этом анеуплоидными были 33,7% 1ПТ и 24,9% 2ПТ). Большинство анеуплоидий были представлены недостающими (в основном в 1ПТ) или лишними хроматидами (в основном во 2ПТ). Аномалии 793 1ПТ представлены следующим образом: 52,2% – отсутствие хроматид; 8,2% – отсутствие хромосом; 16,1% – лишние хроматиды; 1,3% – лишние хромосомы; 19,2% – другие различные типы аномалий. Аномалии 556 2ПТ представлены: 46,6% – лишние хроматиды; 41,7% – недостающие хроматиды. Из 1640 ооцитов, детектированных как нормальные, 1298 были перенесены, получено 107 беременностей, родилось 67 здоровых детей, 32 – спонтанных аборта, 15 – продолжающихся на момент исследования беременностей с подтвержденным нормальным диагнозом. Частота беременности на перенос составила 26,8% для циклов, в которых ооциты отбирали на основе FISH анализа 1ПТ и 2ПТ по сравнению с 20,7%, где проверяли только одно ПТ [8].

Носители транслокаций чаще страдают бесплодием, у них могут случаться спонтанные аборты или рождаться дети с хромосомными аномалиями. Проблемы, связанные с транслокациями, частично решаются с помощью ПГД. Так, после проведения ПГД для определенных транслокаций родились здоровые дети [9]. Для ПГД транслокаций применяются два подхода. Первый подход заключается в разработке и применении специфических зондов для каждого типа транслокаций, эта дорогостоящая методика и на нее затрачивается много времени. С помощью специфических зондов уже детектируются робертсоновские транслокации [10]. Однако такие зонды не могут дифференцировать нормальные эмбрионы от сбалансированных. Последние не подходят для переноса, потому что являются носителями генетических заболеваний в семье и часто имеют тенденцию к спонтанным абортам. Второй подход используется, когда носителем транслокаций является женщина. На препаратах хромосом 1ПТ, находящихся на стадии метафазы, проводят гибридизацию in situ с применением зондов, специфических для определенных хромосом (зонды метятся флюоресцентной меткой разного цвета).

S. Munne и соавт. использовали второй метод для 7 супружеских пар, в которых женщины являлись носителями одной из нижеперечисленных транслокаций: 45,XX,der (13q;14q)(q10;q10) (2 случая); 46,XX,t(4;14)(p15.3;q24); 45,XX,der (14q;21q)(q10;q10); 46,XX,t(7;20)(q22;q11.2); 46,XX,t(9,11)(p24;q12). Метод был усовершенствован: во-первых, для избежания постановки неправильного диагноза в результате ошибочной идентификации хромосомных моновалентов 1ПТ (каждый из которых состоит их двух хроматид) с единичными хроматидами использовали зонды к центромерным областям для одной или обеих хромосом, вовлеченных в транслокацию; во-вторых, для случаев с теломерными транслокациями, когда при гибридизации зонды не захватывали последовательности теломер, использовали меченые зонды на теломерные области. Всего было проверено 26 анормальных, 18 сбалансированных и 22 нормальных яйцеклетки. 9 нормальных и 7 сбалансированных эмбрионов были перенесены, при этом в 8 (50%) случаях произошла имплантация, из которых в 1 случае имел место спонтанный аборт. В остальных случаях родились дети с нормальным кариотипом. Частота спонтанных абортов после ПГД (12,5%) была значительно ниже (p меньше 0,001) по сравнению с естественными циклами для пациентов с аналогичными проблемами [11].

M.Magli и соавт. для одновременной детекции хромосом Х, Y, 13, 16, 18 и 21 применяли FISH с различными флюоресцентными красителями. Критериями отбора пациенток были: возраст матери старше 36 лет, 3 и более предварительных неудачных ЭКО цикла, измененный кариотип. Из 412 эмбрионов, проверенных с помощью FISH, у 234 (57%) были анормальные хромосомы. Эмбрионы с нормальным кариотипом были перенесены 59 пациенткам, получено 19 (32%) беременностей с частотой имплантации 19,9% [12].

D.Manor и соавт. с помощью ПГД проверили 63 эмбриона, полученных в 29 циклах. Показаниями для проведения ПГД были возраст матери старше 39 лет, X-сцепленные заболевания, плохого качества эмбрионы, повторные неудачные ЭКО циклы, быстроделящиеся эмбрионы. 38 дополнительных эмбрионов с несоответствующим размером ядра были проверены на плоидию. Биопсия бластомеров проводилась, когда эмбрионы находились на 6 – 8 клеточной стадии. Для детекции анеуплоидий применяли 5 флюоресцентных зондов для хромосом Х, Y, 13, 18 и 21. Проверенные 84 (87%) бластомера от 73 эмбрионов показали нормальные сигналы. В 5 бластомерах ядра не были выявлены, тогда как в 9 бластомерах обнаружено более чем 1 ядро. 32 эмбриона были перенесены 10 пациенткам. Получены 2 беременности. Родились 2 здоровых ребенка. 56% быстроделящихся эмбрионов дали нормальные сигналы при гибридизации. В двух группах эмбрионов с неправильным размером ядра 50 и 11,4% эмбрионов соответственно продемонстрировали нормальные сигналы. Эффективность FISH при детекции анеуплоидий составила 87 и 97% для аутосом и половых хромосом соответственно [13].

F.Vidal и соавт. с помощью FISH детектировали анеуплоидии для хромосом 13, 16, 18, 21, 22, Y и Х у преимплантационных эмбрионов от 3 пациенток с эмбриональными потерями неясного генеза. Была проведена биопсия 39 эмбрионов, находящихся на 8-клеточной стадии. Анализ бластомеров показал, что хромосомы 17 эмбрионов были нормальными, анеуплоидию наблюдали у 16 эмбрионов и для 6 эмбрионов был получен неоднозначный результат [14].

S.Smith и соавт. у 14 супружеских пар в ЭКО циклах получили 134 эмбриона. Используя одновременно набор ДНК-зондов для хромосом Х, Y, 13, 18 и 21 в сочетании с локус-специфическими ДНК-зондами, авторы выполняли FISH для вышеперечисленных хромосом, выделенных из бластомеров, которые были получены посредством биопсии эмбрионов. FISH-анализ показал, что 22% эмбрионов были нормальными по этим хромосомам, 52% – анормальными и для 25% эмбрионов не могли получить однозначного результата. Для 12 пар был выполнен перенос, у 2 пар перенос не был осуществлен из-за отсутствия нормальных эмбрионов. Беременность наступила в 3 парах [15].

Новые разработки в FISH-технологии

Однако существует три основных ограничения при выполнении FISH для ПГД:

1) FISH ограничивается диагнозом на хромосомном уровне, а не на уровне единичного гена;
2) потеря ядер при приготовлении препаратов бластомеров;
3) время, затраченное для постановки диагноза.

Новыми, альтернативными методами установления пола в единичных клетках, детектирования анеуплоидий и дефектов определенных генов являются методы PRINS и флюоресцентный ПЦР-анализ (Ф-ПЦР). PRINS сходен с методикой FISH, за исключением того, что он не требует предварительного мечения зонда, так как реакция мечения происходит in situ [16].

В процессе отжига олигонуклеотиды формируют гибриды с комплементарными последовательностями и затем действуют как праймеры для синтеза меченой ДНК. Так как олигонуклеотиды немеченые, это приводит к низкому фону. Недавно PRINS использовали для определения пола на эмбрионах человека, и эксперимент дал многообещающие результаты [17].

В последние годы метод ПЦР был автоматизирован с помощью разработанных модификаций в ПЦР технологии. Одной из таких модификаций является метод Ф-ПЦР. В этом методе для детектирования ПЦР продукта используются флюоресцентные праймеры и автоматический ДНК сиквенатор, что улучшает как точность, так и чувствительность метода. Ф-ПЦР очень сходен с обычным ПЦР-анализом за исключением того, что каждый праймер связан с флюоресцентным красителем. Флюоресцентная метка детектируется при более низком уровне гибридизации, чем при проведении обычного ПЦР-анализа. Эта система позволяет точно и надежно проводить детекцию даже в гетерозиготных клетках, где один аллель детектируется очень слабо по сравнению с другим [18]. В последние годы Ф-ПЦР применяется для определения пола на бластомерах человека для ПГД. Было показано, что этот метод имеет высокую (примерно 97%) достоверность [19]. Ф-ПЦР также используется для постановки диагноза на единичных клетках для установления дефектов в конкретных генах, детекции трисомий, при фингепринтировании ДНК и при судебно-медицинских экспертизах.

Одной из модификаций Ф-ПЦР-анализа для детекции анеуплоидий является Ф-ПЦР с использованием полиморфных коротких тандемных повторов (STRs). Амплификация STRs с помощью Ф-ПЦР настолько чувствительна, что может применяться для детекции фетальных трисомий при амплификации фетальной ДНК, выделенной из образцов материнской крови. STRs могут использоваться для выявления лишних хромосом, и если они материнского происхождения, то можно определить, появились ли они в результате первого мейоза или второго [20]. Суть этого метода состоит в том, что у пациентки берут примерно 10 мл амниотической жидкости, из которых 9 мл используется для цитогенетического анализа, а 1 мл – для молекулярно-генетического анализа (для выделения ДНК, используемой в ПЦР). При проведении ПЦР используются праймеры, которые фланкируют данный STRs участок на определенной хромосоме. ПЦР продукты анализируют с помощью гель-электрофореза с последующим сканированием полученных гелей. Результаты сканирования выводятся на дисплей компьютера, полученные пики обсчитываются специальной программой и сравниваются с результатами цитогенетического анализа. Так, при детектировании трисомий на экране компьютера может выявляться три STR пика одинаковой интенсивности или два STR пика в соотношении 2:1 по их величине, указывая на то, что плод унаследовал лишнюю хромосому от одного из родителей. Кроме того, с помощью этого метода можно точно установить, от кого из родителей эмбрион унаследовал лишнюю хромосому, а также в одной ПЦР можно одновременно определить пол эмбриона и любые анеуплоидии по двум маркирующим системам.

E.Mansfield первым доложил о применении этого метода для диагностики синдрома Дауна в 1993 г. [21]. В 1997 г. I.Findlay и соавт. [22] выявляли у 212 беременных женщин фетальные хромосомные аномалии, связанные с материнским возрастом или аномалией плода, предварительно установленные с помощью ультразвука. Они проводили кариотипирование образцов, диагностировали трисомию по хромосомам 21, 18 и 13, используя Ф-ПЦР и STR маркеры, и сравнивали полученные результаты с данными цитогенетического анализа. Из 212 образцов амниотической жидкости в 4 установлена трисомия по хромосоме 21, в 3 – трисомия по хромосоме 18, в 2 – трисомия по хромосоме 13 (все данные согласовались с цитогенетическими результатами). Беременности, где детектировались трисомии, были прерваны. В 3 случаях трисомии по хромосоме 18 лишняя хромосома была унаследована от матери вследствие нерасхождения этой хромосомы в процессе мейоза I. Авторы отмечают значительные преимущества этого метода: детектирование трисомии занимает примерно 4 ч, что дает возможность провести амниоцентез и необходимое прерывание беременности в один день. С помощью специальных наборов выделение ДНК занимает только 50 мин вместо многочасовой процедуры, когда используется метод фенольной экстракции [22].

Применение методов молекулярной биологии в ПГД

На симпозиуме особенно широко представлены работы по ПГД с использованием последних достижений в области молекулярной биологии (конструирование кДНК-библиотек на основе ПЦР; ПЦР, сопряженная с обратной транскрипцией мРНК (РТ-ПЦР); (Ф-ПЦР). Молекулярный анализ транскриптов ранних генов в эмбриогенезе человека может привести к значительным достижениям в контрацепции, вспомогательной репродукции и ПГД.

Прогресс в изучении экспрессии генов в период преимплантационного развития человека тормозился из-за ограниченного количества биологического материала, присутствующего в эмбрионе. После того, как стало возможным создание кДНК-библиотек эмбриона, начались исследования по раннему развитию человека во многих направлениях. Приоритетным направлением исследований является изучение цитогенетической активации генов, изучение механизмов, которые регулируют транскрипцию/трансляцию группы зиготических генов. Чтобы выделить специфично экспрессирующиеся гены из генома эмбриона, в настоящее время используется несколько подходов:

1) дифференциальный ПЦР-анализ. Эта методика, разработанная P.Liang и соавт. [23], может быть использована для идентификации и разделения кДНК, гены которых различно экспрессируются в разных типах клеток и на разных стадиях развития эмбриона. Профиль (набор) экспрессирующихся генов на каждой стадии развития эмбриона может быть выявлен с помощью гель-электрофореза с последующей гибридизацией и радиоавтографией.
2) конструирование библиотек методом вычитания. Такие библиотеки, обогащенные транскриптами, характерными для определенной стадии развития эмбриона, можно создать, удаляя из популяции мРНК данной стадии развития нуклеотидные последовательности, присутствующие в эмбрионах любой другой стадии развития.

Второе направление – это аспекты регуляции экспрессии генов эмбрионов. R.Daniels и соавт. показали, что гены миотониновой протеинкиназы (в основном гены, экспрессирующиеся в мышечных клетках) и a-глобинов (гены, специфические для красных кровяных клеток) экспрессируются в период раннего развития человека [24, 25]. Гены, содержащие CpG-островки (CpG-islands), экспрессируются на этих же ранних стадиях. Было высказано предположение, что экспрессия CpG-island генов может препятствовать метилированию и, следовательно, приводить к мутациям вышеупомянутых последовательностей [26]. В соответствии с этой гипотезой были идентифицированы транскрипты кератина-18, SNRPN (CpG-island гены, предпочтительно экспрессирующиеся в мозге и сердце) [27], транскрипты некоторых других CpG-island тканеспецифических генов эмбрионов [28].

Третье направление – геномный импринтинг. Импринтинговые гены экспрессируются различно в зависимости от того, от кого они унаследованы (от отца или матери). Хотя гены имеют полную гомологию нуклеотидных последовательностей, функция их определяется родительским происхождением. Из этого следует, что импринтинговые гены дифференциально модифицированы в яйцеклетке и сперматозоиде. Возникает интересный вопрос – экспрессировались ли оба аллеля импринтингового гена у родителей до селективного молчания одного из них у потомка. Для выяснения этого вопроса могут быть использованы кДНК-библиотеки эмбриона вместе с геномными библиотеками, приготовленными из образцов тканей родителей (клетки кумулюса и сперматозоидов). При этом должен быть идентифицирован полиморфизм 3’-конца кодирующей последовательности в родительских геномных ДНК-библиотеках и 3’-нетранслируемого района импринтингового гена из кДНК-библиотеки эмбриона для использования этого полиморфизма в качестве маркера при установлении различий между мРНК от каждой родительской копии гена, находящейся в библиотеке эмбриона. Huntriss и соавт. недавно продемонстрировали моноаллельную родительскую экспрессию импринтингового SNRPN гена у преимплантационных эмбрионов человека (неопубликованные данные). SNRPN экспрессия также детектировалась в кДНК-библиотеках (А.Adjaye, Ribugent, Monk, неопубликованные данные), тем самым подтверждая возможность изучения экспрессии импринтинговых генов используя библиотеки эмбрионов.

A.Adjaye и соавт. [29] впервые разработали быстрый и эффективный метод конструирования кДНК-библиотек на основе ПЦР из менее чем 10 клеток фибробластов. Затем они сконструировали кДНК-библиотеки из 8 неоплодотворенных ооцитов и единичных эмбрионов, находящихся на 2, 4, 7-клеточной стадии и на стадии бластоцисты. Дифференциальный ПЦР-анализ при использовании кДНК-библиотек, позволил проанализировать специфическую экспрессию генов эмбрионов, находящихся на разных стадиях развития. Сложность (105–106) полученных библиотек указывает на то, что они представляют популяцию активных генов на ранних стадиях развития человека. Анализ нуклеотидных последовательностей случайных клонов показал присутствие разнообразных транскриптов, таких, как транспозонные элементы LINE-1, последовательности Alu-повторов, универсально экспрессирующиеся в каждой клетке гены (housekeeping gene), тканеспецифические гены (a-глобиновые гены, FMR-1, интерлейкин-10). Также присутствовали с ожидаемой частотой транскрипты генов элементов цитоскелета, b-актина, кератина-18 и a-тубулина. Были детектированы новые последовательности. Некоторые кДНК детектировались только на определенных стадиях преимплантационного развития.

Г.Морозов и соавт. на основе синтеза кДНК-библиотек изучали экспрессию генов эмбрионов, находящихся на преимплантационной стадии развития [30]. Выявлена экспрессия генов b-актина, CD-59, гомеобокса ОСТ-3, а также установлена почти полная идентичность клонированных последовательностей генов гистона 3.1 и рибосомного белка S25 человека. Так как информация о генной экспрессии в период преимплантационного развития ограничена отдельными генами или генными семействами, в другой работе эти же авторы представили результаты систематического изучения экспрессии генов, вовлеченных в преимплантационное развитие через построение кДНК-библиотек из индивидуальных бластоцист человека. При этом они использовали метод, когда большинство полученных из библиотеки кДНК секвенируются. В этом случае могут получаться не полные последовательности генов, а только отдельные их участки (как бы «ярлычки», маркирующие эти гены), которые заносят в банк данных и по которым в дальнейшем можно будет идентифицировать эту последовательность, если она будет выделена из других источников. Отсюда этот метод получил название «метод экспрессирующихся ярлычков» – expressed sequence tags (ESTs). С помощью этого метода было идентифицировано шесть ESTs, два из которых соответствовали housekeeping генам (последовательности гена гексокиназы 1 и серин/треониновой фосфорилазы), а другие четыре последовательности соответствовали ESTs, которые были обнаружены другими авторами в мозговой ткани плода и в клетках опухоли поджелудочной железы. Эти четыре неидентифицированные ESTs могут представлять гены, экспрессия которых необходима для развития бластоцист. Для установления функции этих генов в дальнейшем нужно будет получить полноразмерные клоны этих последовательностей [31].

A.Blaszczyk и соавт. детектировали мутацию в гене фибриллина, расположенного на длинном плече хромосомы 15 [32]. Эта мутация приводит к образованию аутосомно-доминантного заболевания, названного синдромом Марфана. Белок фибриллина кодируется геном, который состоит из 57 экзонов. Ген содержит несколько критических остатков цистеина, обнаруженных в EGF-подобных повторах, которые ответственны за стабильность молекулы белка и связывание с кальцием. Из-за больших размеров гена каждый пациент имеет мутации, характерные только для его родословной. У 26-летнего мужчины была выявлена мутация в 12-м экзоне хромосомы 15. Гетерозиготная мутация С1585Т индуцировала преждевременную остановку транскрипции в этом кодоне, что фенотипически проявлялось в заболевании, связанном с расширением аорты. Пациенту и его жене была предложена ПГД с целью исключить возможность передачи потомству этой мутации. У жены фолликулы были извлечены через 36 ч после стимуляция hCG. 13 ооцитов было оплодотворено с помощью ИКСИ. Из 13 ооцитов 9 оплодотворились нормально. На 3-й день у эмбрионов на 5–8-клеточной стадии была проведена биопсия бластомеров. Для каждого извлеченного бластомера был выполнен «гнездовой» ПЦР-анализ с использованием праймеров, которые амплифицируются с участка, содержащего мутацию в 12-м экзоне хромосомы 15 с последующей DdeI рестрикцией. При проведении гель-электрофореза было выявлено, что для всех бластомеров детектировался один фрагмент размером 179 пар нуклеотидов (п.н.), однако у 5 эмбрионов выявлялись еще 2 дополнительных фрагмента (52 и 127 п.н.), которые получились в результате образования дополнительного сайта для рестриктазы DdeI при гетерозиготной мутации. На 3-й день 4 эмбриона, у которых детектировался только один фрагмент, были перенесены в матку. Положительный результат на b-hCG был получен на 12-й день после переноса. Последующий амниоцентез выявил нормальный плод мужского пола. Были проанализированы продукты амниоцентеза с использованием «гнездового» ПЦР-анализа, описанного выше, в результате которого было подтверждено отсутствие мутации (детектировался только один ПЦР-фрагмент размером 179 п.н.).

В настоящее время большое внимание уделяется ПГД 1ПТ и 2ПТ и возникающих при этом проблем с правильной постановкой диагноза. Основная проблема заключается в том, что при тестировании мутации с помощью ПЦР 1ПТ может быть поставлен неправильный диагноз, так как хромосома 1ПТ состоит из двух сестринских хроматид, и статистически на 50% генотип 1ПТ будет гетерозиготным по мутантным генам. Точный диагноз на наличие определенной мутации может быть поставлен при тестировании 2ПТ с гаплоидным числом одиночных хромосом: если мутация детектируется во 2ПТ, значит ее нет в ооците и наоборот.

Но и при проведении ПЦР 1ПТ и 2ПТ возникают, как правило, еще две проблемы:

1) предпочтительная амплификация одного аллеля или выпадение одного аллеля (ADO). На практике для избежания постановки неправильного диагноза, связанного с ADO, проводят амплификацию двух пар высокополиморфных сцепленных маркеров.
2) возможная контаминация образцов ДНК 1ПТ и 2ПТ материнскими фолликулярными клетками или спермальной ДНК.

Хотя в настоящее время ПГД 1ПТ и 2ПТ для серповидно-клеточной анемии и талассемии выполняется только в нескольких центрах [33], она могла бы применяться более интенсивно, если бы это было доступно, как, например, в районе Средиземноморья, где талассемия распространена. Так, на Кипре у более чем четверти супружеских пар после ПГД две беременности или более прерываются вследствие положительного диагноза талассемии, и поэтому за последние несколько лет случаи талассемии у родившихся детей фактически не наблюдаются.

A.Kuliev проводил ПГД на b-талассемию в 12 клинических циклах, используя биопсию 1ПТ и 2ПТ, извлеченных из ооцитов во время созревания и оплодотворения, с последующим проведением «гнездового» ПЦР-анализа и рестриктного анализа [34]. Из 118 полученных ооцитов 78 были проверены на наличие мутации в 1ПТ и 2ПТ. Это привело к отбору и переносу 30 нормальных эмбрионов (2,5 эмбриона на цикл). Из-за возможности появления ADO при проведении ПЦР для одной клетки одновременно проводили тестирование двух высокополиморфных маркеров: коротких тандемных повторов (STRs), расположенных непосредственно у 5’-конца b-глобинового гена, и синтеничного короткого тандемного повтора (HUMTHO1). Для установления возможной контаминации образцов ДНК 1ПТ и 2ПТ материнскими фолликулярными клетками или спермальной ДНК также тестировались две системы: для STR локуса на хромосоме 21 и для VWF гена на хромосоме 12. Применяя мультиплексный ПЦР-анализ и сцепленные полиморфные маркеры удалось детектировать ADO в пяти 1ПТ, что помогло избежать переноса анормальных эмбрионов.

ADO является одним из наиболее возможных объяснений для трех предварительно доложенных случаев неправильно поставленного диагноза для муковисцидоза (CF) при проведении ПГД с помощью биопсии бластомеров, так как все пораженные эмбрионы были сложными гетерозиготами, т.е. мог быть определен только один из двух мутантных аллелей из гетерозиготных бластомеров, проанализированных ПЦР [35].

S.Rechitsky и соавт. [36] исследовали три типа единичных гетерозиготных клеток на присутствие обоих аллелей, включая бластомеры, фибробласты и 1ПТ, полученных от пациентов с риском рождения детей с CF (мутация delta F-508), гемофилией В и серповидно-клеточной анемией. Была введена одновременная амплификация мутантных генов и их сцепленных полиморфных маркеров, таких как 4-нуклеотидный повтор (GATT), расположенный на 3’-конце 6-го интрона в CFTR гене, 4-нуклеотидный повтор (ATTTT) на 5’-конце b-глобинового гена и HUMTHO1, который является синтеничным с геном b-глобина. Частота ADO была приблизительно в 5 раз выше в бластомерах (33,3%) для delta F-508 мутации и в 3 раза выше для серповидно-клеточной анемии (22,8%) по сравнению с 7,1 и 7,7% для единичных фибробластов и 5,9 и 9,6% для 1ПТ соответственно. Эти результаты были статистически значимыми. Применение одновременной амплификации сцепленных полиморфных маркеров позволило детектировать более половины случаев ADO в бластомерах (19,4% для CF и 12,3% – для b-глобинового гена) и большинство случаев ADO в ПТ.

Комбинирование обоих подходов (сцепленные маркеры и последовательный ПТ анализ) для детекции ADO был применен в 24 клинических циклах ПГД для CF, серповидно-клеточной анемии, гемофилии В и талассемии, что привело к рождению 3 здоровых детей [37]. Последующее изучение эмбрионов, полученных от ооцитов с мутантными аллелями, подтвердило диагноз у 128 из 130 эмбрионов (в 211 из 219 для полиморфных маркеров), демонстрируя тем самым возможность применения и точность постановки диагноза. При этом установлена частота постановки неправильного диагноза приблизительно 1% при одновременном использовании сцепленных маркеров и ПТ-анализа.

Пятикратное повышение частоты ADO в бластомерах по сравнению с ПТ и фибробластами показывает, что не следует использовать биопсию бластомеров для ПГД при рецессивных заболеваниях, когда пациенты являются носителями различных мутаций, X-связанных заболеваний, доминантных заболеваний. Таким образом, вышеизложенные данные показывают, что последовательный ПТ-анализ является предпочтительным методом для ПГД менделевских рецессивных и X-связанных заболеваний, а также при тестировании доминантных заболеваний, когда мать является носителем мутантных аллелей.

Заключение

Итак, ПГД является самой ранней формой пренатальной диагностики, цель которой состоит в том, чтобы не допустить перенос и имплантацию эмбрионов с серьезными генетическими заболеваниями. ПГД в первую очередь предлагается супружеским парам, у которых ожидается повышенная частота появления анеуплоидий, связанная с возрастом матери, а также супружеским парам, имеющим высокий риск рождения детей с нарушениями в единичных генах. Список заболеваний, для которых необходимо проведение ПГД, быстро пополняется и включает возрастные анеуплоидии, муковисцидоз, болезнь Тея–Сакса, гемофилию А и В, пигментный ретинит, серповидно-клеточную анемию, талассемию, синдром Альпорта, синдром ломкой X-хромосомы (синдром Мартина–Белла), миопатию Дюшенна, синдром Леша–Нихена, миотоническую дистрофию, синдром Марфана, хорею Гентингтона, заболевания, связанные с нарушениями в X-хромосоме и т.д. В настоящее время существует 40 ПГД центров в 17 странах, включая США, Бельгию, Англию, Италию, Испанию, Австралию, Израиль, Россию, Белоруссию и т.д. В 28 центрах из 12 стран с применением ПГД выполнено 1200 клинических циклов, приведших к получению 231 беременности (частота беременности 20%) и рождению 166 здоровых детей.

И.К. Гоголевская
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта, Москва

Редакция выражает компании «Органон» признательность за возможность использования сети INTERNET-MEDLINE при подготовке этого обзора.

Литература

1. Edwards R.G., Gardner R.L. Sexing of live rabbit blastocysts. Nature 1967; 214: 567–577.
2. Saiki R.K. et al. Enzymatic amplification of b-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 1985; 230: 1350–1354.
3. Handyside A.H. et al. Pregnancies from biopsied human preimplantation embryos sexed by Y-specific DNA amplification. Nature 1990; 344: 768–770.
4. Harper J.C. et al. Mosaicism of autosomes and sex chromosomes in morphologically normal, monospermic preimplantation human embryos. Prenat Diagn 1995; 15: 41–49.
5. Munne S. et al. Assessment of numeric abnormalities of X,Y,18, and 16 chromosomes in preimplantation human embryos before transfer. Am J Obstet Gynecol 1995; 172: 1191–1201.
6. Delhanty J., Griffin D., Handyside A. et al. Detection of anaploidy and mosaicism in human embryos during preimplantation sex determination by FISH. Hum Mol Genet 1993; 2(8): 1183–1185.
7. Delhanty J.D.A., Harper J.C. et al. Multicolour FISH frequent chromosomal mosaicism and chaotic division in normal preimplantation embryos from fertile patients. Hum Genet 1997; 99(6): 755–760.
8. Verlinsky Y., Cieslak J. et al. Preimplantation diagnosis of common aneuploidies by the first- and second-polar body Fish analysis. Journal of Assisted Reproduction and Genetics 1998; 15: 5: 285–289.
9. Munne S., Scott R. et al. Pregnancies after preconception testing of Robertsonian translocation of maternal origin. Fertil Steril 1998; (in press).
10. Conn C.M., Harper J.C. et al. Infertility couples with Robertsonian translocation: PGDanalysis of embryos reveals chaotic cleavage divisions. Hum Genet 1998; (in press).
11. Munne S. et al. Spontaneous abortions are reduced after preconception diagnosis of translocations. Journal of Assisted Reproduction and Genetics 1998; 15: 5: 290–296.
12. Magli M.C., Gianaroli L. et al. Incidence of chromosomal abnormalities from a morphologically normal cohort of embryos in poor-prognosis patients. Journal of Assisted Reproduction and Genetics 1998; 15: 5: 297–301.
13. Manor D. et al. Preimplantation diagnosis by FISH: the Rambam experience. Journal of Assisted Reproduction and Genetics 1998; 16: 5: 308–309.
14. Vidal F. et al. FISH preimplantation diagnosis of chromosome aneyploidy in recurrent pregnancy wastage. Journal of Assisted Reproduction and Genetics 1998; 15: 5:310–313.
15. Smith S.E. et al. Simultaneous detection of chromosomes X, Y, 13, 18 and 21 by FISH in blastomeres obtained from preimplantation embryos. Journal of Assisted Reproduction and Genetics 1998; 15: 5: 314–319.
16. Hindkjaer J. et al. Fast, sensitive multicolour detection of nucleic acids in situ, by PRINS. Cytogenet Cell Genet 1994; 66: 152–154.
17. Pellestor F. et al. Preimplantation embryo chromosome analysis by PRINS labeling method. Fertil Steril 1996; 66(5): 781–786.
18. Findlay I. et al. Fluorescent polymerase chain reaction. A new method allowing genetic diagnosis and DNA fingerprinting of single cells. Hum Reprod 1996; 2(2):137–152.
19. Findlay I. et al. Allelic dropout and preferential amplification in single cells and human blastomers. Hum Reprod 1995; 10(6): 1609–1618.
20 Kotzot D. et al. Isochromosome 18P results from maternal meiosis-II nondisjunction. Eur J Hum Genet 1996; 4: 168–174.
21. Mansfield E.S. Diagnosis of Down syndrom and other aneuploidies using quantitative PCR and small tandem repeat polymorphisms. Hum Mol Genet 1993; 2: 43–50.
22. Findlay I. et al. Rapid trisomy diagnosis (12, 18, and 13 using fluorescent PCR and short tandem repeats: applications for prenetal diagnosis and preimplantation genetic diagnosis. Journal of Assisted Reproduction and Genetics 15: 5: 266–275.
23. Liang P. et al. Differential display of eucaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science 1992; 257: 967–971.
24. Daniels R. et al. Transcription of tissue-specific genes in human preimplantation embryos. Hum Reprod 1997; 12: 2251–2256.
25. Daniels R. et al. Expression of the myotonin protein kinase gene in preimplantation human embryos. Hum Mol Genet 1995; 4: 389–393.
26. Сross S.H. et al. CpG islands and genes. Curr Opin Genet Dev 1995; 5: 309–314.
27. Reed M.L. et al. Maternal imprinting of human SNRPN, a gene detected in Prader-Willi syndrome. Nature Genet 1994; 6: 163–167.
28. Adjaye J. et al. cDNA libraries from single human preimplantation embryos. Genomics 1997; 46: 337–344.
29. Adjaye A. et al. The construction of cDNA libraries from human single preimplantation embryos and their use in the study of gene expression during development. Journal of Assisted Reproduction and Genetics 1998; 15: 5: 344–348.
30. Verlinsky Y., Morozov G. et al. Isolation of cDNA libraries from individual human preimplantation embryos. Mol Hum Reprod 1998; (in press).
31. Morozov G. et al. Sequence analysis of libraries from individual human blastocysts. Journal of Assisted Reproduction and Genetics 1998; 15: 5: 338–343.
32. Blaszczyk A. et al. Preimplantation genetic diagnosis of human embryos for Marfan’s syndrom. Journal of Assisted Reproduction and Genetics 15: 5: 281–284.
33. Modell B. et al. Community Genetics Services in Europe. Copenhagen, World Health Organization, Regional Office for Europe, Copenhagen, 1991; 137.
34. Kuliev A. Preimplantation diagnosis of thalassemias. Journal of Assisted Reproduction and Genetics 1998; 15: 5: 219–225.
35. Verlinsky Y. et al. Preimplantation diagnosis of genetic and chromosomal diseases. Journal of Assisted Reproduction and Genetics 1994; 11: 236–243.
36. Rechitsky S. et al. Allele dropout in polar bodies and blastomeres. Journal of Assisted Reproduction and Genetics 1998; 15: 5: 253–257.
37. Verlinsky Y. et al. Preimplantation diagnosis of single gene disorder by two-step oocyte genetic analysis using first and second polar body. Biochem Mol Med 1997; 62: 182–187.