Концентрация электролитов в перитонеальной жидкости как фактор подвижности сперматозоидов.
|
Одним из механизмов развития бесплодия, возможно, является угнетение подвижности сперматозоидов в перитонеальной жидкости, обусловленное изменением содержания ионов Ca2+ и Mg2+ в последней по сравнению с нормой.
Успех вспомогательных репродуктивных технологий во многом зависит от качества получаемых при предварительной подготовке сперматозоидов. Используемые для этого среды довольно разнообразны. В основу их композиции положены различные принципы [6], главным из которых является моделирование состава жидкости маточных труб по уровню pH и осмолярности [7]. Биологическая целесообразность применения именно таких сред обусловлена тем, что перитонеальная жидкость (ПЖ), продуцируемая фаллопиевыми трубами, является средой, где происходят процессы миграции гамет и первые этапы жизни вновь возникшего организма [1]. Кроме того, исследованиями последних лет доказано протективное и активирующее действие ПЖ здоровых фертильных женщин на подвижность сперматозоидов в ней [3]. Однако несмотря на определенные успехи в процессах подготовки сперматозоидов для различных программ вспомогательных репродуктивных технологий, актуальным остается вопрос поиска новых сред для отмывания гамет [2]. Так, показано преимущество сред, не содержащих протеин [5]. Используемые для отмывания растворы с различными концентрациями ионов кальция, магния, натрия по своему составу приближаются к сыворотке крови. Цель настоящего исследования состояла в определении влияния на подвижность сперматозоидов различных концентраций ионов, характерных для ПЖ здоровых фертильных и бесплодных женщин. Материал и методы Исследована ПЖ женщин-доноров, поступавших в отделение эндоскопической хирургии Ивановского НИИ материнства и детства им. В.Н. Городкова Минздрава РФ для лапароскопической хирургической стерилизации по социальным показаниям и/или для уточнения причин бесплодия. Мужчины-доноры отбирались по случайному принципу на андрологическом приеме консультативно-диагностической поликлиники института. Все женщины были объединены в две группы: 1-я - 26 женщин с реализованной фертильной функцией и отсутствием органической патологии органов малого таза; 2-я - 154 женщины с бесплодием различного генеза. При проведении лапароскопии у 57 (37%) женщин 2-й группы выявлен наружный эндометриоз различной степени распространения, верифицированный по "колор"-тесту. У 65 (42,2%) женщин имел место хронический сальпингит, причем у 27 (17,5%) из них - гидросальпинкс. У 22 (14,3%) женщин выявлено сочетание наружного эндометриоза и хронического сальпингита. У 10 (5,5%) женщин 2-й группы установлен диагноз "бесплодие неясного генеза": в ходе лапароскопии патологии у них не обнаружено. Возраст женщин 1-й группы составил 36,6±0,9 года, 2-й группы - 33,56±0,8 года. Становление менструальной функции и ее характеристики в обеих группах соответствовали среднестатистическим показателям: средний возраст менархе 13,2±0,3 и 13,4±0,24 года соответственно для 1-й и 2-й групп, длительность менструального цикла - 28-31 день, длительность кровотечения - не более 5 дней (в среднем 4,89±0,1 и 4,75±0,34 дня соответственно). На момент операции стерилизации у всех женщин 1-й группы генеративная функция была полностью реализована. В среднем каждая женщина имела 4,3±0,3 беременности, из которых 2-3 завершились нормальными родами с рождением здорового ребенка, и 2,1±0,3 аборта. У 19,2% женщин в анамнезе зарегистрированы ранние выкидыши. Во 2-й группе у 106 (68,8%) женщин в анамнезе отмечены беременности с различными исходами, у остальных 48 (31,2%) было первичное бесплодие. В среднем у каждой женщины было 3,4±0,65 беременности, 1,4±0,3 родов, 1,6±0,9 абортов, у 12 (7,8%) имели место эктопические беременности, у 10 (6,4%) - ранние выкидыши. Донорами эякулятов явились 48 мужчин в возрасте от 20 до 40 лет из супружеских пар с нормальной репродукцией и бесплодием. По совокупности таких параметров, как общая концентрация сперматозоидов, процент подвижных форм, количество морфологически измененных гамет, уровень лейкоцитов, все эякуляты были объединены в 4 группы: 1-я группа - 19 (39,6%) образцов спермы с нормальными показателями спермограммы, 2-я группа - 15 (31,3%) эякулятов с астеноолигозооспермией, 3-я группа - 9 (18,8%) образцов спермы с воспалительными изменениями в спермограмме, среди них 1 (2,1% к общему числу) с тератозооспермией; 4-я группа - 9 (18,8%) эякулятов с астенозооспермией в сочетании с воспалительными изменениями, среди них 2 (4,2% к общему числу) с тератозооспермией. По возрастным, социальным, общесоматическим характеристикам, состоянию здоровья мужчин сформированные группы были сравнимы и достоверно не различались между собой. Таблица 1. Содержание ионов в ПЖ и сыворотке крови (в ммоль/л)
Примечание. Представлены средние значения, в скобках - индивидуальные колебания. Здесь и в табл. 2: достоверность различий по сравнению с 1-й группой: * -p <0,05, ** - p<0,02, # - p <0,01, ## - p <0,001. Непосредственным материалом для исследования служила ПЖ, аспирированная в момент лапароскопии. Концентрацию ионов Mg2+ в ПЖ определяли колориметрическим способом на аппарате "Micro Vitalab" фирмы "Merck" с использованием реакции с ксилидилом синим, ионов Са2+, Na+, K+ ионоселективным методом с использованием прибора фирмы AVL. Результаты У женщин 1-й группы содержание ионов в ПЖ составило в среднем (ммоль/л): Mg2+ - 0,46±0,01, Ca2+ - 1,09±0,06, Na+ - 136,9±0,52, K+ - 3,93±0,06. Широта индивидуальных колебаний концентраций ионов в ПЖ приведена в табл. 1. Во 2-й группе женщин средние концентрации ионов в ПЖ составили (ммоль/л): Mg2+ - 0,59±0,02, Ca2+ - 1,18±0,01, Na+ - 135,3±0,41, K+ - 3,84±0,03. Причем вариабельность концентраций данных ионов в ПЖ женщин с бесплодием была более значительной, пределы индивидуальных колебаний концентраций ионов в ПЖ в этой группе приведены в табл. 1. Наиболее существенно в ПЖ женщин с бесплодием по сравнению со здоровыми фертильными женщинами изменялась концентрация ионов Mg2+ и Ca2+: средние их величины во 2-й группе оказались достоверно выше, чем в 1-й группе (табл. 1). Анализ индивидуальных значений концентрации ионов в ПЖ у женщин 2-й группы (табл. 2) показал, что содержание ионов Mg2+ в пределах, характерных для женщин 1-й группы, было всего в 36,4% случаев, среди патологических преобладали повышенные концентрации - 42,9% (см. табл. 2). Содержание ионов Ca2+ в пределах нормальных значений отмечено в 60,4% случаев. В 33,8% случаев зафиксировано повышение концентраций ионов Ca2+. Концентрации ионов Na+ и K+ в ПЖ бесплодных женщин оказались гораздо более стабильными. Содержание ионов Na+ в пределах, характерных для женщин 1-й группы, было в 81,2% случаев, в патологических показателях несколько преобладали сниженные значения - 9,1%. Концентрации ионов K+ оказались в пределах нормы в 81,8% случаев, среди патологических также преобладали сниженные значения - 15,4%. С учетом полученных данных о концентрации ионов в ПЖ изучено влияние на подвижность сперматозоидов различных концентраций наиболее вариабельных электролитов - кальция и магния. С этой целью были приготовлены растворы с разными концентрациями данных ионов. Растворы электролитов готовились на основе официнального 0,89% раствора NaCl, в который вносили официнальные (ампульные) растворы 10% СаCl и 25% MgSO. В результате получены две серии растворов с одинаковым содержанием ионов Na+ (154 ммоль/л): 1-я серия - с постоянной концентрацией ионов Ca2+ 2,4 ммоль/л и возрастающими концентрациями ионов Mg2+: 0,2, 0,9, 2,0 ммоль/л; 2-я серия - с постоянной концентрацией ионов Mg2+ 0,9 ммоль/л и возрастающими концентрациями ионов Ca2+ - 1,2, 2,88 ммоль/л. Сперматозоиды отмывали в изотоническом растворе (0,89% раствор NaCl), после чего суспендировали осажденные сперматозоиды в половинном (от исходного объема спермы) объеме физиологического раствора. Суспензию сперматозоидов разделяли на шесть равных по объему частей. Первая проба, куда вносили физиологический раствор NaCl в соотношении 1:1, служила контролем. В каждую последующую пробу вносили раствор электролитов в соотношении 1:1 к объему взвеси сперматозоидов. В результате получилось пять проб, конечные концентрации ионов Са2+ и Mg2+ в которых указаны в табл. 3. Полученные взвеси выдерживали при комнатной температуре в течение 1 ч, после чего определяли подвижность сперматозоидов. Таблица 2. Число индивидуальных наблюдений, выходящих за пределы нормы (2-я группа женщин)
Таблица 3. Конечные концентрации ионов Са2+ и Mg2+ (в ммоль/л) в суспензиях сперматозоидов
Перитонеальная жидкость и подвижность сперматозоидов. Во 2-й пробе, где концентрации ионов Са2+ и Mg2+ соответствовали норме, в 35,4% случаев (17 образцов спермы) подвижность сперматозоидов сохранялась на исходном уровне, в 62,5% случаев (30 образцов спермы) подвижность сперматозоидов повышалась независимо от исходных показателей спермограммы, в 2,1% случаев (1 образец спермы с астенозооспермией) подвижность снижалась. При анализе динамики подвижности по критерию Wilcoxon повышение подвижности сперматозоидов в растворе с концентрацией Са2+ 1,2 ммоль/л и Mg2+ 0,45 ммоль/л носило статистически значимый характер (T = 5,86, p<0,01). В среде с повышенным содержанием ионов Ca2+ (5-я проба) в 100% случаев происходило угнетение подвижности сперматозоидов в среднем на 44,13% от исходной. Еще более агрессивно по отношению к сперматозоидам вела себя среда с повышенным содержанием ионов Mg2+ (3-я проба): в 100% случаев происходило угнетение подвижности мужских гамет, причем особенно выраженное - на 67,8% от фонового уровня, и в 12 (25%) образцах эякулятов подвижных сперматозоидов не определялось вообще. В средах с пониженным содержанием ионов Ca2+ и Mg2+ (1-я и 4-я пробы) в подавляющем большинстве случаев также происходило угнетение подвижности сперматозоидов, но в меньшей степени, чем в средах с повышенным содержанием данных ионов, - в 1-й пробе на 26,4%, в 4-й - на 26,6% от исходной. Так, в 4-й пробе в 95,8% случаев (46 образцов спермы) подвижность сперматозоидов снижалась, в остальных 2 (4,2%) образцах спермы подвижность гамет не изменялась. В 1-й пробе в 87,5% случаев (42 образца спермы) происходило угнетение подвижности сперматозоидов, в 6,3% случаев (3 образца спермы) исходная подвижность сперматозоидов не изменялась, в 6,3% случаев повышалась, что, однако, не носило достоверного характера (p<0,5). Заключение Являясь средой, где происходят процессы миграции гамет и начальные стадии развития зиготы, ПЖ реагирует на любые патологические процессы в репродуктивной системе [1]. Не остается без изменений и электролитный состав данной биологической среды, который, как показало наше исследование, подвержен значительным колебаниям при развитии нарушений в половой сфере женщины. Перитонеальные концентрации ионов у женщин с бесплодием отличаются от таковых у здоровых фертильных женщин. Причем наиболее существенно реагируют концентрации ионов Mg2+ и Ca2+: увеличивается широта колебаний индивидуальных значений концентраций с преобладанием повышенных. Концентрации же ионов Na+ и K+ в ПЖ бесплодных женщин изменяются в гораздо меньшей степени, оставаясь в пределах нормальных в 81,1% случаев для ионов Na+ и в 82,1% случаев для ионов K+. Поскольку Mg2+ и Ca2+ являются одними из ключевых ионов - регуляторов клеточного метаболизма [4], естественно предположить, что изменение их концентраций в ПЖ повлечет за собой нарушения в процессах репродукции. Вычленив из множества потенциальных факторов инфертильности электролитный состав ПЖ, мы спланировали биологический эксперимент таким образом, чтобы выявить влияние отдельно взятого электролита. Доказано, что ионы Ca2+ и Mg2+ непосредственно влияют на подвижность сперматозоидов. Причем в концентрациях, соответствующих содержанию данных ионов в ПЖ здоровых фертильных женщин, ионы Ca2+ и Mg2+ либо не изменяют исходную подвижность сперматозоидов, либо оказывают протективное действие на мужские гаметы - достоверно повышают подвижность сперматозоидов независимо от показателей спермограммы. Этим можно объяснить результаты проведенных ранее исследований [3], в которых описано протективное влияние ПЖ на процессы миграции гамет, однако полностью объяснить его не удалось. При концентрациях, выходящих за пределы нормальных, ионы Ca2+ и Mg2+ оказывают угнетающее действие на подвижность сперматозоидов также независимо от исходных показателей спермограммы. Причем в большей степени этот эффект выражен при воздействии повышенных концентраций данных ионов, в особенности Mg2+. Учитывая, что содержание ионов Ca2+ и Mg2+ в ПЖ женщин с бесплодием повышено, можно предположить, что одним из механизмов развития бесплодия является угнетение подвижности сперматозоидов в ПЖ, обусловленное повышенным или сниженным содержанием в ней ионов Ca2+ и Mg2+. Необходимо отметить, что данный эффект проявляется независимо от исходных показателей спермограммы, что может служить доказательством универсальности ионных механизмов регуляции клеточных процессов, исходя из чего следует рассматривать бесплодие как заболевание супружеской пары, а не отдельного индивидуума. На основании полученных данных можно рекомендовать для отмывания сперматозоидов растворы электролитов с концентрациями ионов, соответствующими нормальным показателям ПЖ: Са2+ - 1,2 ммоль/л и Mg2+ - 0,4 ммоль/л. А.М. Герасимов, Л.В. Посисеева, М.Н. Шохина НИИ материнства и детства им. В.Н. Городкова Минздрава РФ, Иваново Литература 1. Алиханова З.М. Биологические свойства перитонеальной жидкости в норме и при патологии репродуктивной системы. Акуш и гин 1991; 6: 3-6. 2. Воробьева О.А., Корсак В.С. История создания и основные принципы ЭКО. Пробл репрод 1997; 1: 46-50. 3. Посисеева Л.В., Герасимов А.М. Роль перитонеальной жидкости в фертильности женщин. Сб. науч. тр. "Новые технологии охраны здоровья семьи". Иваново 1997; 108-114. 4. Эндокринология и метаболизм: Пер. с англ. Под ред. Ф. Фелига, Дж.Д. Бакстера, А.Е. Бродуса, Л.А. Фромена. М: Медицина 1985; 520. 5. Parinaud J. и др. ЭКО на безбелковой среде. Пробл репрод 1999; 1: 69. 6. William Byrd, Erma Z. Drobnis, William H. Kutteh, Paul Marshburn, ruce R. Carr. Внутриматочная инсеминация размороженной донорской спермой: сравнение трех различных способов подготовки спермы. Проспективное исследование со случайной выборкой. Пробл репрод 1995; 1: 129-130. 7. Zech N., Zech H. Инъекция сперматозоида в цитоплазму яйцеклетки (ИКСИ). Пробл репрод 1997; 4: 46-53. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||